
2-甲基戊烷,由于其具有“可移除"的特性,成為近幾年炙手可熱的高壓冷凍保護劑。越來越多的研究者,將其應用于各種類型的生物樣品中高壓冷凍實驗中。但是,由于其特殊的性質,實驗成功率一直不高。本文將從2-甲基戊烷物化性質入手,逐步深入解析其作為高壓冷凍保護劑的優勢,及其與其他常用冷凍保護劑的差別,最后介紹兩種2-甲基戊烷“移除"方法,并指出了導致實驗失敗的可能原因。
Part 1:2-甲基戊烷物化性質
2-甲基戊烷鏈狀烷烴,極性低,不溶于水。2-甲基戊烷沸點低,閃點低(表1),意味著它在室溫下極易揮發并產生可燃蒸汽,與空氣混合可形成爆炸性混合物,遇到明火、高熱或火花極易引發燃燒爆炸。同時,其揮發的蒸汽對眼睛、皮膚和呼吸道有刺激性,接觸后會產生灼燒感。
因此,在使用2-甲基戊烷的時候,需要注意通風,預防明火,并佩戴護具,做好個人防護。

表1. 2-甲基戊烷物理化學性質
Part 2:2-甲基戊烷作為高壓冷凍保護劑的優勢
可去除性
這是2-甲基戊烷的特性,其可以通過低溫洗滌或者升華去除,解決了傳統高壓冷凍保護劑無法去除的痛點。
易形成玻璃態:
2-甲基戊烷在降溫時,將直接轉變為玻璃態,而不形成晶體,此特性對保護樣品內部結構的完整性至關重要
高導熱性
2-甲基戊烷在高壓環境下,能夠高效地傳導熱量,確保樣品被瞬間、均勻地冷凍。
Part 3:2-甲基戊烷 vs 十六碳烯&BSA
如表2所示,2-甲基戊烷與十六碳烯類似,均為有機烴類物質,具有相似的熱導率和低溫相態,并且其對樣品的保護機制均是替代樣品外層多余水分,抑制外層冰晶生長。兩者最主要的區別在于去除性,2-甲基戊烷能夠通過低溫升華或洗滌去除,比較適合全冷凍制樣路線;而十六碳烯則需要有機溶劑溶解,比較適合冷凍-常溫的冷凍替代路線。
與上述兩者不同,牛血清蛋白(BSA)主要以水溶液形式存在,其主要是通過與生物大分子結合、維持水化層等方式,減少低溫導致的蛋白質變性/聚集,本質上是一個穩定劑而非導熱介質。并且,由于其含有大量水,容易產生冰晶,反而會破壞樣品結構,另外BSA與水共存,不具備可去除性。
注意誤區!!! 熱導率 ≠ 導熱性能
看了上一段的讀者可能會產生一個疑問,冰的熱導率為2.2W/m*k(-20°C),遠高于2-甲基戊烷和十六碳烯,但為什么還說BSA不算導熱介質呢?
這里需要澄清一個概念:熱導率 ≠ 導熱性能。
對于高壓冷凍而言,我們看重的導熱性能,不僅僅指的是冷凍保護劑在理想狀態下的熱導率,更取決于其冷凍過程中實際的物理狀態。
換句話說就是,盡管固體冰具有很高的熱導率,但是一旦形成了冰,就失去了高壓冷凍制樣的意義了。
因此,對于高壓冷凍而言,冷凍保護劑有效的熱導性能 = 熱導率 * 形成均一玻璃態的能力。

表2. 2-甲基戊烷、十六碳烯和BSA性能對比表
Part 4:2-甲基戊烷的去除方法
如表3所示,2-甲基戊烷的去除方法主要有低溫洗滌和原位升華。
其中,低溫洗滌主要利用2-甲基戊烷的溶解性,在低溫下進行溶劑置換,進行保護劑去除。上述方法需要有一個可控溫度的環境,需要嚴格把控洗滌時間,否則容易造成樣品表面損傷。并且,低溫洗滌容易殘留微量的有機溶劑。
原位升華方法,則是利用了2-甲基戊烷的揮發性,在高真空條件下,精準控制樣品溫度,升華保護劑。整個過程需要對樣品溫度有精準把控,溫度不能太高,否則容易造成2-甲基戊烷不可控形態變化,甚至樣品玻璃態冰轉化為晶體冰。該方法的優點在于,能夠無殘留地去除保護劑。

表3. 2-甲基戊烷低溫洗滌或原位升華去除方法
Part 5:2-甲基戊烷實驗失敗的可能原因
物理因素:熱應力與相變
1
熱膨脹系數差異:2-甲基戊烷與載網金屬材質熱膨脹系數差異巨大,在低溫洗滌過程中,不同材質收縮程度不同,產生強烈、不均勻的熱應力,破壞樣品固定力,將樣品從載網上“擠下來"。
2
相變風險:洗滌過程若發生微小的溫度波動,可能破壞樣品玻璃態結構,導致冰晶重排或再結晶,將樣品從載網上“推下來"。
機械因素,流體沖刷
1
物理沖刷:液態乙烷/丙烷洗滌2-甲基戊烷過程中,會對樣品產生直接物理沖擊,足以把吸附力較弱的樣品,從載網上“沖下來"。
2
升華應力:升華過程中,若溫度控制不當,則容易導致2-甲基戊烷快速升華,并帶走周圍熱量,產生拉伸力,將樣品從載網上“拉下來"。
物理化學因素:界面作用力破壞
1
黏附機制:樣品和載網黏附方式,往往取決于兩者之間的范德華力或者靜電力。有機溶劑洗滌過程,可能會直接削弱或破壞這些粘附力,使樣品從載網上“落下來"。
2
微觀生物機制:某些生物樣品,能夠通過表面特殊結構,如菌毛等,將其錨定在載網上。2-甲基戊烷作為一種有機溶劑,可能會將這些錨點溶解或破壞,使樣品從載網上“掉下來"。
如同所有的高壓冷凍保護劑,2-甲基戊烷的可去除性既是其獨特優點,又是造成實驗失敗的最主要原因。只有深入了解其作用機制,精準控制每一步參數,才能步步為營,獲得真實的樣品信息。
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